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dargestellt. Die 1D-Säule wird mit einer Flussrate betrieben, die für eine 2,1 mm-i. d.-Säule als niedrig angesehen wird (30 μl/min), in erster Linie, damit das Volumen des in die 2D-Säule injizierten 1D-Eluats nicht zu groß ist (20 μl). Dies ist hier besonders wichtig, weil jede dieser Fraktionen mehr als 75 % organisches Lösungsmittel enthält, während jede 2D-Trennung mit 60 % organischem Lösungsmittel beginnt, und das meiste dieser organischen Stoffe ist MeOH, das für RP-Trennungen ein schwächeres Lösungsmittel als ACN ist. Eine Erhöhung der 1D-Flussrate und damit des Volumens des 1D-Eluats, der mit jeder Fraktion in die 2D-Säule injiziert wird, würde zu einer starken Verbreiterung der 2D-Peaks führen.
Tab. 1.1 Zusammenfassung der Bedingungen für die IPRP-IPRP-Trennung von farbstoffmarkierten Oligonukleotiden.
| Erste Dimension Säule: RP (C18); 50 mm × 2,1 mm i. d., 1,7 μm Gradientenelution von 66 bis 76 % B Lösungsmittel A: 100 mM Hexylamin-Acetat, pH 7 Lösungsmittel B: MeOH Durchflussrate: 0,10 ml/min Temperatur: 60 °C Injektionsvolumen: 1 μl Analysezeit: 30 min |
| Zweite Dimension Spalte: RP (C18); 50 mm × 2,1 mm i. d., 1,7 μm Gradientenelution von 20 bis 70 % B Lösungsmittel A: 15 mM Triethylamin, 400 mM Hexafluorisopropanol in Wasser, pH 8 Lösungsmittel B: MeOH Durchflussrate: 0,25 ml/min Temperatur: 60 °C Analysezeit (pro Fraktion): 20 min. |
| Schnittstelle Doppelte Ventile mit sechs Anschlüssen, mit direkter Überführung der Fraktion in die 2D-Säule |
Die 2D-Säule ist relativ kurz (50 mm), schmal (2,1 mm i. d.) und mit kleinen Partikeln (1,8 μm) gepackt, was die in der zweiten Dimension erforderlichen schnellen Trennungen begünstigt. Die Säulentemperatur beträgt 80 °C, was die Verwendung einer für diese Säule als hoch angesehenen Flussrate (2 ml/min) erleichtert [31]. Es werden steile Gradienten verwendet, sodass die Dauer jedes 2D-Zyklus nur 33 s beträgt, was dazu beiträgt, das Undersampling zu minimieren und die Trennung der 1D-Peaks, die von der 1D-Säule vor der Probenahme bereitgestellt werden, aufrechtzuerhalten.
Abb. 1.6 Trennung der Bestandteile von kommerziellem PS20 mittels LC × LC mit HILIC- und RP-Säulen in der ersten bzw. zweiten Dimension. Angepasst mit Genehmigung nach [30].
1.6 Ausblick
Zurzeit beobachten wir eine rasche Verbreitung von 2D-LC-Methoden in Anwendungsbereichen, die von der pharmazeutischen Analyse bis zur Lebensmittel- und Getränkeanalyse reichen. Die Zahl der 2D-LC-Anwender wächst schnell, parallel zu den kontinuierlichen Fortschritten der kommerziell verfügbaren Technologie für 2D-LC und dem verbesserten grundlegenden Verständnis der Technik. Ich erwarte, dass wir in naher Zukunft sorgfältige und kritische Bewertungen der Robustheit dieser Technologie sehen werden. Dies wird für die breitere Nutzung der Technik wichtig sein, da verschiedene Branchen die Möglichkeit der Implementierung von 2D-LC-Methoden in regulierten und Qualitätskontrolllabors in Betracht ziehen. Die Entwicklung schlankerer Ansätze zur Methodenentwicklung (im Gegensatz zu den oben diskutierten erfahrungsbasierten Ansätzen), die wahrscheinlich von der Entwicklung von Software-Werkzeugen für diesen Zweck erheblich profitieren werden (In-Silico-Ansätze), ist dringend erforderlich und wird eine große Wirkung haben, wenn sie in der Praxis eingesetzt werden können. Gegenwärtig werden fast alle mehrdimensionalen LC-Trennungen auf Zeitbasis durchgeführt, d. h. die 1D-Trennung und die anschließende 2D-Trennung von 1D-Eluatfraktionen werden nacheinander durchgeführt. Parallel durchgeführte 2D-Trennungen wären vor diesem Hintergrund attraktiv. Solche Trennungen wurden bereits vor Jahrzehnten untersucht [32], standen damals aber vor ernsthaften technischen Herausforderungen. Diese Ideen werden jetzt vor allem von der Schoenmakers-Gruppe [33] wieder aufgegriffen, und derartige 3D-Trennungen könnten dank der explosionsartigen Zunahme der 3D-Druckmöglichkeiten in der Praxis eingesetzt werden, besonders für sehr komplexe Proben. Schließlich wird sich die Forschung in Bezug auf 2D-LC auf Strategien zur Datenanalyse konzentrieren, damit die Anwender leichter die Informationen aus datenreichen Chromatogrammen, wie in Abb. 1.6 dargestellt, extrahieren können.
Tab. 1.2 Zusammenfassung der Bedingungen für die HILICxRP-Trennung von PS20.
| Erste Dimension Spalte: HILIC (nackte Kieselsäure); 100 mm × 2,1 mm i. d., 1,8 μm Gradientenelution von 98 bis 0 % B Lösungsmittel A: 10 mM Ammoniumformiat, pH 3 in 50/50 ACN/Wasser Lösungsmittel B: ACN Durchflussrate: 30 μl/min Temperatur: 30 °C Injektionsvolumen: 1 μl Analysezeit: 120 min |
| Zweite Dimension Spalte: RP (C18); 50 mm × 2,1 mm i. d., 1,8 μm Gradientenelution von 20 bis 100 % B Lösungsmittel A: 5 mM Ammoniumformiat, pH 3 in 50/50 MeOH/Wasser Lösungsmittel B: 5 mM Ammoniumformiat, pH 3 in 50/50 Ethylacetat/MeOH Durchflussmenge: 2 ml/min Temperatur: 80 °C Analysezeit (pro Fraktion): 33 s |
| Schnittstelle Doppelschleifen-Design mit 20 μl-Schleifen, im Gleichstrommodus betrieben |
Danksagung
Ich möchte Dr. Gabriel Leme für die Erstellung von Abb. 1.1 danken.
Literatur
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2 Hamase, K., Morikawa, A., Ohgusu, T., Lindner, W. und Zaitsu, K. (2007). Comprehensive analysis of branched aliphatic D-amino acids in mammals using an integrated multi-loop two-dimensional column-switching high-performance liquid chromatographic system combining reversed-phase and enantioselective columns. Journal of Chromatography A 1143 (1–2): 105–11, https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.12.078.
3 Wang, H., Sun, S., Zhang, Y., Chen, S., Liu, P. und Liu, B. (2015). An off-line high pH reversed-phase fractionation and nano-liquid chromatography – Mass spectrometry method for global proteomic profiling of cell lines. Journal of Chromatography B 974: 90–95, https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2014.10.031.
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5 Horváth, K., Fairchild, J.N. und Guiochon, G. (2009). Optimization strategies for off-line two-dimensional liquid chromatography. Journal of Chromatography A 1216 (12): 2511–2518, https://doi.org/10.1016/j.chroma.2009.01.064.
6 Fairchild, J.N., Horváth, K. und Guiochon, G. (2009). Approaches to comprehensive multidimensional liquid chromatography systems. Journal of Chromatography A 1216(9): 1363–1371, https://doi.org/10.1016/j.chroma.2008.12.073.
7 Erni, F. und Frei, R.W. (1978b). Two-dimensional column liquid chromatographic technique for resolution of complex mixtures. Journal of Chromatography A 149: 561–569, https://doi.org/10.1016/S0021-9673(00)81011-0.